清光绪二十五年（1899年）初，周树人再次离家到南京，改考江南陆师学堂。恰巧在陆师学堂开办了矿路学堂，其性质与“格致书院”相似，因为附设在陆师学堂，故名称不叫书院而叫矿路学堂。周树人不能成为正式陆军学生，而是进入了矿路学堂。
矿路学堂创办于清光绪二十一年（1895年），是洋务派张之洞仿照德国体制搞起来的。他认为陆军与铁路有特殊关系，便在陆师学堂下设置一所铁路学堂。后来，刘坤一接任，听说南京附近的青龙山有蕴藏量丰富的煤矿，开煤矿非常有利可图，便决定在学堂里设置矿务班，培养一批具有开矿专门知识的人才。于是，便形成了矿路学堂。
矿路学堂的课程重点在开矿，以铁路为辅，开设有算学、格致（物理与化学）、金石学（矿物学）、地学（地质学）、历史等课程。这些课程，对周树人来说，一些自然科学初次接触，实在是非常新鲜。虽然画铁轨断面图什么的有些麻烦，但他过去是善长画画的。当时金石学有江南制造局的《金石识别》可用，地学却是要用手抄本的，他发挥了旧日影写画谱的本领，非常精细地照样子抄写了一部。
在矿路学堂学习期间，周树人学习十分勤奋刻苦。他在班上年龄最小，而成绩却是最好的。学堂里有规定，每月考试一次，考第一名的学生可以得到一枚三等银牌，有了四枚三等银牌可以换取一枚二等银牌，攒够四枚二等银牌又可以换取一枚五钱重的金牌。周树人是这个班中惟一的一名获得了金牌的学生。他得到金牌以后并不向别人炫耀，而是把它卖掉，将大部分钱寄给家里，一小部分钱留下来买书用了。他知道家里现在已经很困难，不可能接济他学习费用，学堂每月发给的津贴不够用，在矿路学堂读书期间的生活只能靠自己节俭了。冬天，学堂发放的棉衣薄得不足以御寒，他就多吃辣椒来增加体内热量，结果竟然养成了吃辣椒的习惯。
周树人处处注意节省，每次回家都是自己扛行李，不像别的学生那样找挑夫。在船上，当地的地痞无赖常常在开船前抢占船仓里睡觉的地方，然后卖给乘客收取“卧铺费”。大多数乘客都害怕这些地痞无赖，只好花钱买他们强占的铺位。但是，周树人偏偏不吃他们那一套，从来不花钱买他们的铺位，他把自己的行李往那儿一放，坐在行李上面眼睛微闭，任凭那些地痞无赖怎么样威吓就是不予理睬，如此对峙到要开船的时候，那些并不乘船的地痞无赖只好乖乖地滚蛋。于是，被那些地痞无赖抢占的地方空出来了，周树人从容地打开行李铺好便舒舒服服地一直睡到绍兴。在与地痞无赖的斗争中，他认识了社会恶势力的外强中干本性，一切恶势力并不可怕，必须和他们进行针锋相对的斗争。
矿路学堂的总办是由陆师学堂总办兼职的。当初陆师总办是钱德培，据说是绍兴“钱店官”出身，懂得德语，陆师学堂是按照德国体制办的，聘请的都是德国教官，所以这位总办就有用武之地了。后任的总办是俞明震（字恪士），虽然也是候补道，却是新派人士，是一位很开通的人。他思想活跃，每天坐在马车上还阅读维新派报纸《时务报》，给学生出国文题再也不是论管仲或汉高祖之类，而是出了一道《华盛顿论》，结果连国文教师都弄不明白，还要问学生华盛顿是个什么人。周树人对他一直很有敬意，在日记中说及这位总办时称他为“俞师”。
在总办俞明震的倡导下，学堂里设立了阅报处，不但有总办喜欢的《时务报》，还有传播国外新说的《译学汇编》。周树人每天都到这里来阅读。
周树人在南京修业期间，所得到的提高确实不小。文史方面知识底子是在家里就打下的，而一般的自然科学知识则是在南京上学时学得的。此外加上一点《天演论》，便造成他的唯物思想的基础。
一次，周树人从南京城南书店买到一本《天演论》，使他爱不释手，读得着了迷。这本《天演论》是维新派严复根据英国人赫胥黎的著作《进化论与伦理学》翻译过来的。严复针对旧中国贫穷落后的状况，借着“物竞天择”、“优胜劣败”的进化学说，在书中阐述了自己的观点。他认为，在这个竞争激烈的世界上，中华民族不思进取图强，就要受帝国主义列强的欺侮，总有一天在这个星球上将无法生存下去。书中充满着激情，严谨的说理，优美的文笔，流畅的语言，使周树人深深地被打动了，从中吸取了进化论的思想，激发了他学习西方先进科学知识的热情。此后，严复的新译作一出版，他就买来阅读。他阅读了甄克斯的《社会通论》、斯宾塞的《群学肄言》、孟德斯鸠的《法意》及《穆勒名学部甲》等著作，从此，周树人开始如饥似渴地大量阅读西方译著。
与此同时，周树人还广泛阅读西方文学名著，成为正在风靡一时的林琴南翻译小说的狂热读者，阅读了《生长术》、《茶花女遗事》、《撒克逊劫后英雄传》、《全探记》（福尔摩斯探案全集）等。从这些小说开始，周树人接触西方文学，对文学产生了浓厚的兴趣，激发了他的文学创作冲动。在矿路学堂期间，周树人不仅学习成绩很好，而且开始显露出文学方面的才华。此时，他开始使用“戛剑生”等别号，创作了大量的诗文，如《戛剑生杂记》、《莳花杂志》（1898年）、《别诸弟三首》、《莲蓬人》（1900年）、《庚子送灶即事》、《祭书神文》、《惜花四律》、《别诸弟三首》、《挽丁耀卿联》（1901年）。周树人在这些作品中满怀深情地倾诉了对故乡和亲人的眷恋之情，表达了安贫乐道的书生情怀和对于人格的执著追求。这些作品，已经充分显露出他对文学的迷恋和他的文学天分。
在矿路学堂这段日子，是周树人最开心快乐的时光。学生们穿的服装和警察制服差不多，而且又都是吃官饷的，每逢走在街上路遇不平而出面相助的时候，警察总是站在学生一边来，真有意思。可是，后来见到学生们出来请愿，警察却把学生当成敌人一样对待了，真是让人气愤！
那时候，周树人最得意的事是骑马。他和几个同学受了陆师的影响，喜欢骑马，还刻了一块石章，上面刻了四个字“戎马书生”。他们课余练习骑马，练得很刻苦，摔下来爬上去再练。有一次，周树人从马上摔下来，碰断了一个门牙竟然满不在乎，爬上马继续练。他的骑马技术提高得很快。骑术也还不错，敢和旗人子弟竞赛。清朝的旗人子弟是以善于骑射而自豪的，对于汉人骑马是很不满意的。有一次，竞赛中竟然遭到了旗人暗算。一个旗人把腿脚放在马脖子上急速奔驰过来，在擦肩而过的一瞬间用马鞍子迅速地刮周树人的腿脚。这是很厉害的一遭，甚至可以将腿刮断将脚刮掉的。周树人差一点从马上跌下来。周树人和同学们还常骑马跑到故宫一带去。那时候，故宫是八旗官兵驻防的地方，他们的气焰虽然在太平天国以后已经下去不少，但还是对汉族人存有很大的歧视，至少汉人骑马跑到那里去是很不平安的，要是遇见叫骂或投石头打过来，还是很麻烦甚至很危险的。有一次，一个旗人军官怒气冲冲地骑马冲过来，在贴近周树人时突然抬起腿向他踢来，显然，这是旗人自恃善于骑射而故意伤人，幸亏周树人平时练得一身好骑术，躲避敏捷，没有受到伤害。周树人他们冒险去访问故宫，自然是由于他们年少血气方刚，但更主要的还是他们出于民族思想，具有一种养成革命精神，决心练好骑术，将来驰骋疆场报效国家的胸怀。
学习了三年关于开矿筑路的课程，加上第三年到句容青龙山煤矿去考察实习，接触到了实际的采矿生产情况，周树人所得到的益处实在是不小，这不仅是在技术方面，更重要的是在自然科学知识方面。
清光绪二十七年十二月十八日（1902年1月27日），周树人从矿路学堂毕业了。他排在一等第三名。这样的成绩已经很不错了，但他自己并不满意，觉得自己所掌握的知识还远远不够，要想为改变祖国的贫穷落后状态做出贡献，还必须进一步深造，还必须掌握更大的本领，于是，他像当时的有志之士一样，把求知的希望寄托在出国留学上。